菌落總數(shù)的檢驗方法
一、菌落總數(shù)介紹：

　　菌落是指細菌在固體培養(yǎng)基上生長繁殖而形成的能被肉眼識別的生長物，它是由數(shù)以萬計相同的細菌集合而成。當(dāng)樣品被稀釋到一定程度，與培養(yǎng)基混合，在一定培養(yǎng)條件下，每個能夠生長繁殖的細菌細胞都可以在平板上形成一個可見的菌落。

　　菌落總數(shù)就是指在一定條件下（如需氧情況、營養(yǎng)條件、pH、培養(yǎng)溫度和時間等）每克（每毫升）檢樣所生長出來的細菌菌落總數(shù)。按國家標(biāo)準方法規(guī)定，即在需氧情況下，37℃培養(yǎng)48h，能在普通營養(yǎng)瓊脂平板上生長的細菌菌落總數(shù)，所以厭氧或微需氧菌、有特殊營養(yǎng)要求的以及非嗜中溫的細菌，由于現(xiàn)有條件不能滿足其生理需求，故難以繁殖生長。因此菌落總數(shù)并不表示實際中的所有細菌總數(shù)，菌落總數(shù)并不能區(qū)分其中細菌的種類，所以有時被稱為雜菌數(shù)，需氧菌數(shù)等。

　　菌落總數(shù)測定是用來判定食品被細菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量，它反映食品在生產(chǎn)過程中是否符合衛(wèi)生要求，以便對被檢樣品做出適當(dāng)?shù)男l(wèi)生學(xué)評價。菌落總數(shù)的多少在一定程度上標(biāo)志著食品衛(wèi)生質(zhì)量的優(yōu)劣。 

二、檢驗方法

　　菌落總數(shù)的測定，一般將被檢樣品制成幾個不同的10倍遞增稀釋液，然后從每個稀釋液中分別取出1mL置于滅菌平皿中與營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混合，在一定溫度下，培養(yǎng)一定時間后（一般為48小時），記錄每個平皿中形成的菌落數(shù)量，依據(jù)稀釋倍數(shù)，計算出每克（或每ml）原始樣品中所含細菌菌落總數(shù)。

　　基本操作一般包括：樣品的稀釋－－傾注平皿－－培養(yǎng)48小時－－計數(shù)報告。

　　國內(nèi)外菌落總數(shù)測定方法基本一致，從檢樣處理、稀釋、傾注平皿到計數(shù)報告無何明顯不同，只是在某些具體要求方面稍有差別，如有的國家在樣品稀釋和傾注培養(yǎng)進，對吸管內(nèi)液體的流速，稀釋液的振蕩幅度、時間和次數(shù)以及放置時間等均作了比較具體的規(guī)定。

三、說明

（一）樣品的處理和稀釋：

　　1．操作方法：以無菌操作取檢樣25g（或25ml)，放于225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(nèi)（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振要或研磨制成1：10的均勻稀釋液。
固體檢樣在加入稀釋液后，最好置滅菌均質(zhì)器中以8000~10000r/min的速度處理1min，制成1：10的均勻稀釋液。
用1ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管混合均勻，制成1：100的稀釋液。
另取1ml滅菌吸管，按上項操作順序，制10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次即換用1支1ml滅菌吸管。

　　2．無菌操作：操作中必須有“無菌操作”的概念，所用玻璃器皿必須是完全滅菌的，不得殘留有細菌或抑菌物質(zhì)。所用剪刀、鑷子等器具也必須進行消毒處理。樣品如果有包裝，應(yīng)用75%乙醇在包裝開口處擦拭后取樣。
操作應(yīng)當(dāng)在超凈工作臺或經(jīng)過消毒處理的無菌室進行。瓊脂平板在工作臺暴露15分鐘，每個平板不得超過15個菌落。

　　3．采樣的代表性：如系固體樣品，取樣時不應(yīng)集中一點，宜多采幾個部位。固體樣品必須經(jīng)過均質(zhì)或研磨，液體樣品須經(jīng)過振搖，以獲得均勻稀釋液。

　　4．樣品稀釋誤差：為減少樣品稀釋誤差，在連續(xù)遞次稀釋時，每一稀釋液應(yīng)充分振搖，使其均勻，同時每一稀釋度應(yīng)更換一支吸管。
在進行連續(xù)稀釋時，應(yīng)將吸管內(nèi)液體沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀釋液內(nèi)，以免吸管外部粘附的檢液溶于其內(nèi)。
為減少稀釋誤差，SN標(biāo)準采用取10mL稀釋液，注入90mL緩沖液中。

　　5．稀釋液：樣品稀釋液主要是滅菌生理鹽水，有的采用磷酸鹽緩沖液（或0.1％蛋白胨水），后者對食品已受損傷的細菌細胞有一定的保護作用。如對含鹽量較高的食品（如醬油）進行稀釋，可以采用滅菌蒸餾水。

（二）傾注培養(yǎng)

　　1．操作方法：根據(jù)標(biāo)準要求或?qū)ξ廴厩闆r的估計，選擇2~3個適宜稀釋度，分別在制10倍遞增稀釋的同時，以吸取該稀釋度的吸管移取1ml稀釋液于滅菌平皿中，每個稀釋度做兩個平皿。
將涼至46℃營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約15ml，并轉(zhuǎn)動平皿，混合均勻。同時將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1ml稀釋液（不含樣品）的滅菌平皿內(nèi)作空白對照。
待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2h，取出計算平板內(nèi)菌落數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得每克（每毫升）樣品所含菌落總數(shù)。

　　2．傾注用培養(yǎng)基應(yīng)在46℃水浴內(nèi)保溫，溫度過高會影響細菌生長，過低瓊脂易于凝因而不能與菌液充分混勻。如無水浴，應(yīng)以皮膚感受較熱而不燙為宜。
傾注培養(yǎng)基的量規(guī)定不一，從12~20ml不等，一般以15ml較為適宜，平板過厚可影響觀察，太薄又易于干裂。傾注時，培基底部如有沉淀物，應(yīng)將底部棄去，以免與菌落混淆而影響計數(shù)觀察。

　　3．為使菌落能在平板上均勻分布，檢液加入平皿后，應(yīng)盡快傾注培養(yǎng)基并旋轉(zhuǎn)混勻，可正反兩個方向旋轉(zhuǎn)，檢樣從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用時間不宜超過20min，以防止細菌有所死亡或繁殖。。

　　4．培養(yǎng)溫度一般為37℃（水產(chǎn)品的培養(yǎng)溫度，由于其生活環(huán)境水溫較低，故多采用30℃）。培養(yǎng)時間一般為48h，有些方法只要求24h的培養(yǎng)即可計數(shù)。培養(yǎng)箱應(yīng)保持一定的濕度，瓊脂平板培養(yǎng)48h后，培養(yǎng)基失重不應(yīng)超過15％。

　　5．為了避免食品中的微小顆?；蚺嗷械碾s質(zhì)與細菌菌落發(fā)生混淆，不易分辨，可同時作一稀釋液與瓊脂培基混合的平板，不經(jīng)培養(yǎng)，而于4℃環(huán)境中放置，以便計數(shù)時作對照觀察。
在某些場合，為了防止食品顆粒與菌落混淆不清，可在營養(yǎng)瓊脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培養(yǎng)后菌落呈紅色，易于分別。

（三）計數(shù)和報告

　　1．操作方法：培養(yǎng)到時間后，計數(shù)每個平板上的菌落數(shù)?？捎萌庋塾^察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌落總數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落數(shù)，計算處原始樣品中每克（或每ml）中的菌落數(shù)，進行報告。

　　2．到達規(guī)定培養(yǎng)時間，應(yīng)立即計數(shù)。如果不能立即計數(shù)，應(yīng)將平板放置于0－4℃，但不得超過24h。

　　3．計數(shù)時應(yīng)選取菌落數(shù)在30~300之間的平板（SN標(biāo)準要求為25~250個菌落），若有二個稀釋度均在30~300之間時，按國家標(biāo)準方法要求應(yīng)以二者比值決定，比值小于或等于2取平均數(shù)，比值大于2則其較小數(shù)字（有的規(guī)定不考慮其比值大小，均以平均數(shù)報告）。

　　4．若所有稀釋度均不在計數(shù)區(qū)間。如均大于300，則取最高稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。如均小于30，則以最低稀釋度的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)報告之。如菌落數(shù)有的大于300，有的又小于30，但均不在30~300之間，則應(yīng)以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。如所有稀釋度均無菌落生長，則應(yīng)按小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報告之。有的規(guī)定對上述幾種情況計算出的菌落數(shù)按估算值報告。

　　5．不同稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)與稀釋倍數(shù)成反比（同一稀釋度的二個平板的菌落數(shù)應(yīng)基本接近），即稀釋倍數(shù)愈高菌落數(shù)愈少，稀釋倍數(shù)愈低菌落數(shù)愈多。如出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，則應(yīng)視為檢驗中的差錯（有的食品有時可能出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，如酸性飲料等），不應(yīng)作為檢樣計數(shù)報告的依據(jù)。

　　6．當(dāng)平板上有鏈狀菌落生長時，如呈鏈狀生長的菌落之間無任何明顯界限，則應(yīng)作為一個菌落計，如存在有幾條不同來源的鏈，則每條鏈均應(yīng)按一個菌落計算，不要把鏈上生長的每一個菌落分開計數(shù)。如有片狀菌落生長，該平板一般不宜采用，如片狀菌落不到平板一半，而另一半又分布均勻，則可以半個平板的菌落數(shù)乘2代表全平板的菌落數(shù)。

　　7．當(dāng)計數(shù)平板內(nèi)的菌落數(shù)過多（即所有稀釋度均大于300時），但分布很均勻，可取平板的一半或1/4計數(shù)。再乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)作為該平板的菌落數(shù)。

　　8．菌落數(shù)的報告，按國家標(biāo)準方法規(guī)定菌落數(shù)在1~100時，按實有數(shù)字報告，如大于100時，則報告前面兩位有效數(shù)字，第三位數(shù)按四舍五入計算。固體檢樣以克（g)為單位報告，液體檢樣以毫升（ml）為單位報告，表面涂擦則以平方厘米（cm2）報告。